存在電荷、分子量或其他性質(zhì)不同的多個變異體是單克隆抗體(mAb)的共同特征。與主要物種相比，這些電荷變體通常被稱為酸性或堿性。主要物種的化學(xué)性質(zhì)通常是眾所周知的，但了解酸性和堿性變體的化學(xué)性質(zhì)，以及這三個物種之間的差異，對于工藝開發(fā)和配方設(shè)計至關(guān)重要。然而，完全了解酸性和堿性物種是具有挑戰(zhàn)性的，因為已知這兩個物種都包含多種修飾。本文將簡單介紹用色譜技術(shù)分離的酸性和堿性物種的表征，及其對抗體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物學(xué)功能的影響。

 

基于電荷的分離技術(shù)

由于多個翻譯后修飾和降解事件，單克隆抗體(mAb)的生化和生物物理特性具有異質(zhì)性。用等電聚焦凝膠電泳(IEF)、毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)凝膠電泳、陽離子交換層析(CEX)和陰離子交換層析(AEX)等基于電荷的分離技術(shù)分析mAb時，經(jīng)常會觀察到變異。與主要物種相比，這些變體通常被稱為酸性或堿性物種。當(dāng)用基于IEF的方法分析抗體時，酸性物種是表觀等電點較低的變體，堿性物種是表觀等電點較高的變體。當(dāng)用基于色譜的方法進(jìn)行分析時，酸性物種和堿性物種是根據(jù)它們相對于主峰的保留時間來定義的。酸性種是早于CEX主峰或晚于AEX主峰洗脫的變體，堿性種是晚于CEX主峰或早于AEX主峰洗脫的變體。

雖然人們普遍同意使用基于離子交換和色譜的方法觀察到的酸性和堿性物種的分布和數(shù)量，但由于分離機制的不同，可能存在細(xì)微的差異。IEF根據(jù)總電荷差(表觀PI)來分離抗體變體，但除了總電荷外，電荷分布在層析分離抗體變體中起著關(guān)鍵作用，因為它可能會影響抗體與柱樹脂的相互作用。例如，當(dāng)用IEF分析時，具有兩個重鏈上的天冬氨酸(Asp)或一個重鏈上的一個天冬氨酸(Asp)和另一個重鏈上的一個異門冬氨酸(IsoAsp)的重組單抗在IEF分析時具有相同的等電點，因此，沒有預(yù)期的等電點差異，然而可以通過強陽離子交換(SCX)柱來分離。這表明，基于色譜的分離并不僅僅依賴于總電荷，因為即使在沒有電荷差異的情況下也可以實現(xiàn)分離。因此，盡管分離的主要驅(qū)動力是電荷差，但基于理論計算或基于IEF方法的實驗確定的表觀等電點可能不足以預(yù)測色譜分離方法的洗脫順序。

主要物種

主要種類是在色譜圖上作為主峰洗脫的抗體。主要種類不一定對應(yīng)于未修飾或未降解的抗體。事實上，主峰通常由三種典型的翻譯后修飾的抗體組成：(1)N-末端谷氨酰胺(Gln)環(huán)化為焦谷氨酸；(2)去除重鏈C-末端賴氨酸(Lys)；(3)CH2結(jié)構(gòu)域中保守的天冬酰胺(ASN)殘基與中性寡糖的糖基化。N-末端谷氨酰胺編碼在輕鏈和重鏈中的一條或兩條基因中，合成后可以自發(fā)環(huán)化形成焦谷氨酸(PyroGlu)。大多數(shù)抗體在分析時含有N-末端焦谷氨酸，而不是原來的谷氨酰胺，因此洗脫為主峰。類似地，重鏈C-末端賴氨酸也編碼在重鏈基因中。羧肽酶對C端賴氨酸的不完全去除會導(dǎo)致抗體中沒有、有一個或兩個C端賴氨酸殘基。主要品種通常為沒有任何C端賴氨酸的抗體。CH2結(jié)構(gòu)域中保守的ASN殘基被N-連接的寡糖糖基化。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的重組mAb的主要糖型為核巖藻糖基化的復(fù)合雙天線結(jié)構(gòu)，其末端有0、1或2個半乳糖殘基。

酸性物種

酸性物種被定義為在CEX分析中早于主峰或在AEX分析中晚于主峰的抗體變異體。圖1總結(jié)了酸性物種形成的主要原因。

唾液酸通常被報道有助于酸性物種的形成。在NS0細(xì)胞中表達(dá)的重組IgG1抗體的酸性組分中檢測到唾液酸。在CHO細(xì)胞系中表達(dá)的重組IgG1抗體的酸性組分中也含有較高水平的唾液酸。用唾液酸酶處理后，發(fā)現(xiàn)酸性物種的百分比大大降低，這表明唾液酸的存在是這些酸性物種的主要原因。

ASN殘基的脫酰胺化也被廣泛報道為酸性物種的主要原因。脫酰胺化既發(fā)生在可變區(qū)，特別是在暴露的和靈活的互補決定區(qū)(CDR)，也發(fā)生在恒定區(qū)(圖2)。CDR區(qū)ASN殘基的脫酰胺化幾乎肯定會導(dǎo)致酸性物種的產(chǎn)生。雖然isoAsp和Asp側(cè)鏈上的PKA差異很小，但輕鏈CDR1上帶有isoAsp33的抗體及其Fab片段的洗脫時間要晚于相同位置上帶有Asp33的抗體，而且兩者都比含有原始ASN殘基的抗體洗脫得更早。具有相同位置的 isoAsp 或 Asp 的抗體在不同保留時間洗脫的事實表明影響電荷分布的構(gòu)象差異，因此是抗體與柱樹脂相互作用的證據(jù)。CH2區(qū)的與氨基酸序列LNGK， CH3結(jié)構(gòu)氨基酸序列SNGQPENNYK和 LHNHYTQK，以及輕鏈恒定區(qū)LLNNFYPR的脫酰胺化也已報道。

雖然不像唾液酸和脫酰胺化那樣被廣泛觀察到，但其他修飾也被證明會導(dǎo)致酸性物種的產(chǎn)生。例如，當(dāng)使用AEX分析時，含有三硫鍵的抗體(最先在重組人IgG2中發(fā)現(xiàn))比主峰洗脫得晚，因此對應(yīng)于酸性種類。一種高甘露糖含量的抗體變體也在重組mAb的酸性部分中略有富集，盡管高甘露糖低聚糖和具有核心巖藻糖的復(fù)雜雙天線低聚糖之間沒有電荷差異。這再次強調(diào)了基于色譜的分離不僅僅基于電荷差異。糖基化，還原糖與賴氨酸殘基的側(cè)鏈或N-端伯胺之間的反應(yīng)，由于正電荷的中和，導(dǎo)致酸性物種的形成。

酸性種類對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

由于導(dǎo)致酸性物質(zhì)產(chǎn)生的各種修飾對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的潛在影響高度依賴于它們的位置。由于柔性鉸鏈區(qū)，位于Fc區(qū)的修飾可能不會對Fab片段產(chǎn)生顯著影響。例如，唾液酸的存在不會影響抗體效力。位于Fab區(qū)的修飾，特別是CDR區(qū)的修飾，最有可能對抗原結(jié)合和效力產(chǎn)生實質(zhì)性的影響。圖3總結(jié)了脫酰胺化的影響。鉸鏈區(qū)的三硫鍵的存在已被證明不會影響IgG2抗體的熱穩(wěn)定性。Lys糖基化可以在不改變抗體構(gòu)象的情況下增加聚集體的形成，這表明Lys糖基化引起的表面正電荷減少可能會降低抗體分子之間的排斥力?？贵w重鏈 CDR2 中 Lys 殘基 (K65) 的 10% 糖基化不會影響其結(jié)合親和力。

堿性物種

堿性物種被定義為在CEX分析過程中晚于主峰、在AEX分析過程中早于主峰洗脫的物質(zhì)。圖4總結(jié)了導(dǎo)致堿性物種產(chǎn)生的修飾。形成堿性物質(zhì)的一個主要原因是C末端Lys的不完全去除。由于額外的正電荷，具有重鏈C-末端Lys的mAb比主要物種更堿性。羧肽酶B(CPB)能特異性去除C端堿性氨基酸殘基，對比CPB消化前后抗體的色譜圖，可以清楚地證明C端賴氨酸對堿性物種形成的貢獻(xiàn)。

對堿性物種有貢獻(xiàn)的另一種常見修飾是輕鏈或重鏈的N-末端谷氨酰胺(Gln)不完全環(huán)化為焦谷氨酸，或兩者兼而有之。谷氨酰胺最初是在基因中編碼的，但它可以發(fā)生自發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生焦谷氨酸(PyroGlu)。含有原始谷氨酰胺的抗體具有比主要物種更高的表觀等電點，因此被稱為堿性物種。

天冬氨酸異構(gòu)化已被廣泛報道。與脫酰胺化類似，異構(gòu)化在CDR區(qū)域頻繁發(fā)生，很少在恒定區(qū)發(fā)生。當(dāng)用CEX分析時，重鏈CDR3中含有isoAsp102的重組單抗比含有原始天冬氨酸的抗體洗脫得晚。琥珀酰亞胺是天冬酰胺脫酰胺化和天冬氨酸異構(gòu)化的常用中間體，也有助于堿性物種的產(chǎn)生。CDR區(qū)琥珀酰亞胺為天冬氨酸異構(gòu)化產(chǎn)物的重組mAb的洗脫時間晚于CEX相同位置天冬氨酸的抗體洗脫時間。以琥珀酰亞胺為ASN55去酰胺化產(chǎn)物的抗體在CEX的堿性區(qū)域洗脫出重鏈CDR2。琥珀酰亞胺作為天冬氨酸74異構(gòu)化產(chǎn)物存在于CDR區(qū)外，也導(dǎo)致堿性物種的形成。

其他幾種修飾也能產(chǎn)生堿性物種。Fc區(qū)兩個保守蛋氨酸(Met)殘基氧化的抗體在堿性區(qū)域洗脫。mAb CDR2區(qū)域的Met殘基也會導(dǎo)致堿性物種的產(chǎn)生。除去重鏈C-末端賴氨酸和前一個甘氨酸殘基后的脯氨酸殘基的酰胺化也可導(dǎo)致堿性物種的形成。重鏈可變區(qū)有未形成二硫鍵的重組mAb比CEX柱上有完整二硫鍵的抗體洗脫得晚，因此代表一個堿性物種。具有一個糖基化重鏈和一個帶有短寡糖的重鏈的抗體也從CEX中晚洗脫出來作為堿性物種。一個非共價Fab-Fab二聚體在WCX-10柱上的洗脫時間晚于Fab單體?？贵w聚集體和片段已被檢測為堿性物種。由于碎片也以酸性物種的形式富集，碎片的電荷性質(zhì)可能在影響其色譜洗脫順序方面起著關(guān)鍵作用。

堿性種類對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能的影響

與關(guān)于酸性物種類似，形成堿性物種修飾的位置是否對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物功能有任何影響是至關(guān)重要的?？贵w的N端或C端的修飾不會對抗體的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能產(chǎn)生實質(zhì)性的影響，因為這些區(qū)域是高度暴露的，并且不是任何配體結(jié)合位點的一部分。含有兩個重鏈N-末端焦谷氨酸的抗體效價與含有一個焦谷氨酸和一個谷氨酰胺的同一抗體的效價沒有差異。C-末端賴氨酸不影響重組IgG1抗體的熱穩(wěn)定性，也不影響補體依賴性細(xì)胞毒(CDC)介導(dǎo)的效價。去除Lys和Gly后C末端脯氨酸殘基的酰胺化對抗原結(jié)合或Fc效應(yīng)功能沒有影響。

與N-末端或C-末端區(qū)域的修飾相比，其他區(qū)域的修飾更有可能對結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物功能產(chǎn)生實質(zhì)性影響。具有不成對的二硫鍵的FAB的效力僅為含有完全形成的二硫鍵的FAB的~28%。以isoAsp102為異構(gòu)化產(chǎn)物的含有抗體的分離組份的效價僅為含有原始Asp102殘基的主峰組份的9-21%。

一些研究已經(jīng)證實了琥珀酰亞胺的形成對抗原結(jié)合親和力和效力的影響。有研究報道，與具有原始 Asn 殘基的 Fab 相比，在重鏈 CDR2 中包含琥珀酰亞胺 55 的 Fab 片段顯示出結(jié)合親和力降低 50%，與具有原始 Asn 殘基的抗體相比，具有琥珀酰亞胺的抗體的效力降低了 70% 。在輕鏈CDR1中具有琥珀酰亞胺32的Fab具有16%的結(jié)合親和力和~42%的效力。

Fc區(qū)Met殘基的氧化不影響重組mAb的抗原結(jié)合力和效價；然而，它確實引起了構(gòu)象變化，主要是在CH2結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致熱穩(wěn)定性降低和聚集傾向增加。由于兩個Met氧化位于多個配體的結(jié)合位點附近，這些殘基的氧化減少了與蛋白A、蛋白G和FcRn的結(jié)合，但對Fcγ受體結(jié)合的影響很小。此外，這些Met殘基的氧化導(dǎo)致體內(nèi)半衰期顯著縮短。差示掃描量熱法(DSC)測定重鏈CDR2區(qū)Met殘基的氧化導(dǎo)致抗體熱穩(wěn)定性降低。

酸性物種和堿性物種的表征策略

雖然餾分收集幾乎是徹底表征酸性和堿性物種的第一步，但在餾分收集之前通過酶消化確定唾液酸對酸性物種的貢獻(xiàn)和C-末端賴氨酸對堿性物種的貢獻(xiàn)可能是有益的。唾液酸和C-末端賴氨酸都可以在自然條件下被酶消化特異性地去除，而這種條件不會對抗體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生實質(zhì)性的影響。單獨使用唾液酸酶可以很容易地去除唾液酸，或者使用PNGaseF可以很容易地與整個N-連接的寡糖一起去除唾液酸。C端賴氨酸可以通過CPB消化很容易去除。比較這些酶處理后酸性或堿性物種的百分比，將確定這些修飾對酸性或堿性物種總數(shù)的貢獻(xiàn)。

在許多情況下，加速樣本被用來產(chǎn)生更高水平的酸性或堿性物種，用于餾分收集。數(shù)據(jù)然后外推，以確定在非加速藥物物質(zhì)中存在的極低水平的酸性和堿性物種的性質(zhì)。然而，觀察到藥物物質(zhì)和加速樣品中的酸性物種和堿性物種具有相同的保留時間，這可能也不足以支持它們是由于相同的修飾而形成的結(jié)論。通常需要進(jìn)一步的證據(jù)來證實在不同條件下產(chǎn)生的酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)在性質(zhì)上是相同的。即使修改的性質(zhì)相同，機制也可能不同。例如，Met256和Met432的氧化。兩種殘基都被氧化或者它們都不在藥物物質(zhì)中的一條或兩條重鏈上并且在加速穩(wěn)定條件下被氧化。然而，常用的tBHP化學(xué)氧化導(dǎo)致兩個重鏈上的兩個Met殘基被隨機氧化。

控制分析人工產(chǎn)物的水平對于表征酸性和堿性物種也是至關(guān)重要的。在收集碎片和準(zhǔn)備樣品以進(jìn)行詳細(xì)分析時，可以很容易地引入人工制品。首先，在餾分的收集、濃縮、緩沖液交換和儲存過程中，不能完全避免將餾分暴露在不同的pH、攪拌、室溫和冷凍/解凍循環(huán)中。因此，諸如聚集、氧化和脫酰胺化之類的修飾可以作為人工產(chǎn)物產(chǎn)生。

小編總結(jié)

在單抗產(chǎn)生過程中，?？捎^察到酸性和堿性物種。完全消除酸性和堿性物種是不切實際的，也是沒有必要的。有一些可能是重組單抗所特有的修飾，它們或者與特定的宿主表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)或者發(fā)生在生產(chǎn)和配制過程中(例如，硫代硫化物修飾)。對生物功能的影響高度依賴于修飾的部位和水平。對于定位于Fc區(qū)域的修飾，即使存在更高水平的修飾也可能不會對結(jié)合親和力產(chǎn)生直接影響。同樣，定位于Fab區(qū)的修飾可能不會影響Fc相關(guān)功能，如受體結(jié)合。然而，在許多情況下，完全理解酸性物種和堿性物種的性質(zhì)仍然是具有挑戰(zhàn)性的。在任何情況下，都有必要評估酸性或堿性物種與主峰在穩(wěn)定性和功能方面的差異。修飾可能是關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)或關(guān)鍵過程屬性(KPA)。因此，酸性和堿性物種的信息對于建立與最終目標(biāo)的可比性和相似性至關(guān)重要，以確保治療性重組mAb的有效性和安全性。

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