抗體為基礎(chǔ)的免疫療法在各種類型的癌癥中顯示出臨床有效性。然而，其靶標(biāo)范圍僅限于表面或可溶性抗原，而這些抗原在癌癥蛋白質(zhì)組中只占相對較小的比例。人類蛋白質(zhì)組中的大多數(shù)蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的。而來自細(xì)胞內(nèi)的短肽可以被細(xì)胞表面的MHC I類（MHC-I）分子所呈現(xiàn)，使其成為使其成為癌癥免疫治療的潛在目標(biāo)?？梢蚤_發(fā)出針對這些肽/MHC復(fù)合物的抗體，以發(fā)揮類似TCR識別MHC-I/肽復(fù)合物的功能。這些抗體被稱為T細(xì)胞受體模擬（TCRm）或TCR樣抗體。

一項癌癥蛋白質(zhì)組研究分析了17種主要癌癥類型的轉(zhuǎn)錄組。發(fā)現(xiàn)有500多個基因與正常細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)，其中近一半的基因編碼的是細(xì)胞內(nèi)蛋白。而另外一些蛋白質(zhì)表達(dá)在細(xì)胞表面，它們可以成為癌癥免疫療法的目標(biāo)如mAb和CAR-T。這些細(xì)胞外蛋白包括CD19, CD20, CD22, CD47, CD52,CD80, CD123,HER2, EGFR, mesothelin, GPC3, GPC2, GD2, B7-H3和PD1/PDL1。然而，細(xì)胞內(nèi)的癌癥靶點并不能很好地被這些免疫療法所利用。因此，有必要開發(fā)出能夠在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行免疫治療的藥物。

 

細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可以被蛋白酶體降解8到10個氨基酸長的短肽。這些短肽被MHC I類（MHC）呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。一些肽/MHC復(fù)合物(pMHC)已被證明與各種癌癥有關(guān)，因此其可以成為TCR治療的潛在靶標(biāo)。這些復(fù)合體可以被用于開發(fā)抗體。靶向pMHC的抗體通常被稱為TCR模擬（TCRm）或TCR-like抗體，因為它們能夠像T細(xì)胞上的TCR一樣識別復(fù)合物。肽來自于各種細(xì)胞內(nèi)的腫瘤抗原如病毒性腫瘤基因產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄因子、胎盤蛋白、癌睪丸抗原等或來自突變的癌基因的新抗原。TCRm抗體擴(kuò)大了治療目標(biāo)的范圍，具有廣泛的臨床潛力。

 

腫瘤中pMHC靶標(biāo)的選擇

 

開發(fā)TCRm抗體時，pMHC的選擇主要考慮以下因素：表位的豐富程度，癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的特異性，MHC分子的表達(dá)，以及在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的異質(zhì)性。TCRm抗體的理想目標(biāo)是一個癌癥特異性pMHC復(fù)合物，該復(fù)合物在目標(biāo)細(xì)胞表面有很高的密度，而在正常細(xì)胞上不存在。或者是目標(biāo)抗原在腫瘤生長中具有功能性甚至是關(guān)鍵性作用，從而避免在隨后的治療中，該抗原因治療壓力而丟失。該多肽還應(yīng)該對病人的MHC有很高的親和力，并形成一個穩(wěn)定的復(fù)合物，且在腫瘤細(xì)胞表面持續(xù)表達(dá)，從而允許TCRm抗體的識別。TCRm抗體開發(fā)的一個主要挑戰(zhàn)是腫瘤細(xì)胞往往下調(diào)MHC-I的表達(dá)。

 

HLA是pMHC復(fù)合物的一個主要部分，因此選擇HLA進(jìn)行癌癥治療非常重要。HLA I在不同的人類群體中有超過20000個等位基因。同一個癌原性的肽可能在不同的人群中中呈現(xiàn)有不同的HLA等位基因。因此，開發(fā)TCRm抗體時，為了能以擴(kuò)大其臨床應(yīng)用，HLA亞型的選擇應(yīng)需要重點考慮。有研究表明，在白種人中最常見的HLA I類等位基因是HLA-A02, 24,01和HLA-B_35, 44, 51;而亞洲人種中為HLA-A_24, 02, 26和HLA-B_40, 51, 52; 非裔巴西人中主要為HLA-A_02, 03, 30 和HLA-B_35, 15, 44。因此，HLA-A_02是TCRm抗體開發(fā)比較理想的候選者。

 

根據(jù)其短肽成分的來源，pMHC復(fù)合物可大致分為以下兩大類腫瘤相關(guān)抗原（TAA），包括過度表達(dá)的蛋白質(zhì)，和腫瘤特異性抗原（TSA）。TSA包括腫瘤特別的融合蛋白、致癌病毒抗原和變異的自身抗原。表1中所列的抗原已被研究證明的細(xì)胞表面表達(dá)的pMHC復(fù)合物，使其成為TCR細(xì)胞治療或CRm抗體開發(fā)的目標(biāo)。目前，細(xì)胞表面的pMHC復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)和驗證主要是通過復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，包括質(zhì)譜分析等，因此目前可以靶向的pMHC復(fù)合物相當(dāng)有限，這也在一定程度上限制了TCRm抗體的開發(fā)。

 

 

TAA

 

TAAs主要由腫瘤細(xì)胞表達(dá)，并與惡性腫瘤細(xì)胞表型相關(guān)，這是靶向癌癥免疫療法的基礎(chǔ)。在TAAs中，異常過度表達(dá)的抗原是最大的一類，研究表明，針對部分TAAs抗原（如，癌胚胎抗原WT1，α-甲胎蛋白和在黑色瘤中表達(dá)的PRAME和NY-ESO-1等腫瘤-睪丸抗原）的一些療法已經(jīng)取得初步成功，如疫苗、過繼性細(xì)胞療法和抗體等。癌胚胎抗原WT1和AFP在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)，并且在一些特定的腫瘤中也表達(dá)，但在健康的成人組織中的表達(dá)非常有限。癌睪丸抗原包括MAGE基因家族和NY-ESO1在幾種腫瘤類型中高度表達(dá)，但在健康的成人組織中的表達(dá)幾乎檢測不到。這些TAAs已被充分證明，可以作為CTL，TCR-T或者TCRm抗體的有效靶標(biāo)，用于腫瘤的治療。

 

TSA

 

TSA是癌癥免疫治療比較有吸引力的靶標(biāo)，因為TSA是由腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的，因此免疫治療效果僅限于腫瘤，并且能最小化脫靶導(dǎo)致的副反應(yīng)。目前研究表明，某些融合蛋白僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，如BCR-ABL和PMMA。BCR-ABL融合（費城染色體）是由9號染色體和22號染色體之間的易位導(dǎo)致的。這種易位對CML的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，在95%的CML患者中可以檢測到，而在正常細(xì)胞中則沒有。PML-RARa融合引起的易位，是急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）的一個標(biāo)志性特征。這種易位產(chǎn)生的融合蛋白作為一種異常的視黃醇受體，具有異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性。有研究使用BCR-ABL肽作為疫苗，但是在臨床中療效有限。

 

另外一種TSA是致癌病毒的抗原。據(jù)統(tǒng)計，人類癌癥中約有12%是由病毒引起的。目前已知有七種病毒可以導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，包括EB病毒（EBV）、人乳頭瘤病毒（HPV），乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），人類T淋巴細(xì)胞病毒1（HTLV-1）、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒（KSHV）和梅克爾多元癌細(xì)胞病毒（MCPyV）。致癌病毒的致癌作用是復(fù)雜的，只有一小部分受感染的人會發(fā)展成癌癥，而且往往是在最初感染后的許多年或幾十年才發(fā)生。這些病毒的致癌基因在癌細(xì)胞中為構(gòu)成性表達(dá)，因此它們成為癌癥治療較好的靶標(biāo)。開發(fā)TCRm抗體治療EB病毒相關(guān)的癌癥已被證明是可行的。EB病毒與一些癌癥有關(guān)，如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌。來自EBV的多肽，包括EBNA1562-570、LMP1125-133和LMP2A426-424由HLA-A0201呈現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞表面，因此這些多肽成為TCR抗體的潛在目標(biāo)。研究結(jié)果表明，用TCRm抗體治療EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞的異種移植小鼠時，這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長被抑制，而且小鼠的存活率顯著提高。另外，TCR細(xì)胞療法靶向HPV E6或E7多肽復(fù)合物也取得了一定的效果。

變異的自身抗原或新生抗原是癌癥免疫療法的最佳目標(biāo)，因為它們僅在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)細(xì)。然而，腫瘤突變的在腫瘤患者之間并不完全相同，只有少數(shù)患者有相同的新生抗原。在大多數(shù)情況下，針對這些不同的新生抗原開發(fā)TCRm抗體是非常困難并具有一定的挑戰(zhàn)，因為其臨床應(yīng)用比較有限。幸運(yùn)的是，研究發(fā)現(xiàn)了頻發(fā)突變（recurrent mutations）（>1%的的患者），這些可能是頻發(fā)性的新抗原，如P53，KRAS和 Myc。腫瘤抑制因子p53在各種癌癥中失調(diào)，因此是免疫治療的重要目標(biāo)。p53在結(jié)直腸癌中有兩個常見的突變R175H和R282W，突變的頻率為9.5%。最近的一項研究開發(fā)了一種針對p53 R175H突變的TCRm雙特異抗體。該雙特異性抗體能有效地激活T細(xì)胞，并特異性的殺傷具有這種突變的癌細(xì)胞。KRAS突變在多種癌癥中都比較常見，如胰腺癌(70%-90%），結(jié)腸癌（35%-50%），小腸癌（35%），膽道癌（35%），(35%），膽道癌（20%-30%）和肺癌（20%-35%）。在胰腺癌患者中，KRAS G12D是最常見的突變（32.4%），其次為G12D突變（22%）。有研究證明，靶向KRAS G12V突變肽與HLA-A3復(fù)合物的雙特異抗體能對腫瘤進(jìn)行了特性殺傷。

 

pMHC復(fù)合物的表達(dá)
 

pMHC是由HLA I類重鏈、b2-微球蛋白(b2M)，以及來自腫瘤抗原的肽組成的復(fù)合物。肽位于HLA分子的結(jié)合槽中，MHC分子的側(cè)鏈和肽的骨架之間通過比較保守氫鍵相互結(jié)合。一個pMHC復(fù)合物的原生構(gòu)象對于分離出一個成功的TCRm抗體至關(guān)重要。使用目前的技術(shù)，如雜交技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)，生產(chǎn)pMHC復(fù)合物的抗體具有一定的挑戰(zhàn)性，因此TCRm抗體并不像傳統(tǒng)的抗體容易獲得。

 

重組pMHC復(fù)合物的出現(xiàn)，推動了TCR抗體的發(fā)展。使用不同的策略來分離TCR抗體，首先需要相對大量的純化的MHC-肽復(fù)合物。起初，有研究者將MHC分子的重鏈和b2M利用細(xì)菌單獨表達(dá)并且通過包涵體純化獲得，然后，它們將MHC與肽重新折疊，產(chǎn)生正確的重新折疊的pMHC復(fù)合物（圖2B），這些獲得的復(fù)合物需要通過功能實驗和其它一些實驗驗證復(fù)合物結(jié)構(gòu)的正確性?？偟膩碚f，與其他細(xì)菌或哺乳動物表達(dá)的抗原制備相比，該方式產(chǎn)量很低，而且生產(chǎn)過程很繁瑣。為了提高生產(chǎn)效率，有研究者將MHC重鏈和B2M和肽通過linker連接，并且以融合蛋白的形式表達(dá)（圖3）這些重組的pMHC復(fù)合物可以被不同的TCR識別，與原生的pMHC復(fù)合物相似。結(jié)構(gòu)研究顯示，其與天然的pMHC復(fù)合物在結(jié)構(gòu)上有一些差別，特別是在a1a2結(jié)構(gòu)域。然而，在抗原結(jié)合活性上，兩者的差異可能比小。最初，這些融合蛋白的主要是用于產(chǎn)生四聚體或其他多價染色試劑用于觀察T細(xì)胞。pMHC單體的構(gòu)象在四聚體的應(yīng)用中可能并不重要。然而，一個原生的pMHC單體可能是TCRm抗體篩選比較理想的抗原。pMHC抗原生產(chǎn)的開發(fā)和優(yōu)化將是TCRm抗體發(fā)現(xiàn)的重要研究領(lǐng)域。

 

 

TCRm抗體的篩選和表達(dá)

 

在過去，TCRm抗體的篩選比較困難。但是隨著技術(shù)的進(jìn)步，包括上述的pMHC復(fù)合物的表達(dá)，TCRm抗體的開發(fā)已經(jīng)有了很大的進(jìn)展。越來越多的針對腫瘤和病毒抗原的TCRm抗體已經(jīng)被開發(fā)，包括WT1, AFP, PRAME, NY-ESO-1, MAGEA1,hTERT、TARP、Tyrosinase、hCGbeta、p53、p68 MIF、蛋白酶3，MAGE3和EB病毒蛋白。雜交瘤以及噬菌體展示進(jìn)行體外篩選是目前兩種主要方法（圖2A）。另外，單個B細(xì)胞分選和克隆也逐漸成為TCRm抗體篩選的一種選擇。雜交瘤技術(shù)的主要優(yōu)點是，其分選到的TCRm抗體可能對pMHC復(fù)合物有較高的高親和力，這是因為這些抗體在免疫過程可能經(jīng)歷過親合力成熟的過程。然而，該方法需要穩(wěn)定的MHC復(fù)合物與肽有較高的親和力，因為這是免疫有效的前提，而且是抗體成熟中所必須的。另外，通過這種方法篩選的抗體進(jìn)入臨床實驗，也必須進(jìn)行人源化，以消除抗體的免疫原性。

 

噬菌體展示技術(shù)很大程度的促進(jìn)了TCRm抗體篩選的成功。在分離TCRm抗體方面取得了成功。特異性對于TCRm抗體的成功很重要，噬菌體展示可以結(jié)合陰性和陽性篩選來分離出高度特異性的TCRm抗體，而雜交瘤通常不能做到這一點。噬菌體展示的另一個重要特點是抗體庫通常具有很大的多樣性。抗體可以Fab或者scFv的形式展示在噬菌體顆粒上。該方法的主要優(yōu)點是可以對目標(biāo)進(jìn)行廣泛的選擇并且在短時間內(nèi)獲得目的抗體。另一個優(yōu)點是，其可以產(chǎn)生完全人源化的抗體，因此無需進(jìn)行人源化。然而，來自噬菌體庫的TCRm抗體的親和力通常具有較低，因此可能需要親和力的成熟。

 

TCRm抗體與pMHC復(fù)合物結(jié)合的方式?jīng)Q定了其性質(zhì)

 

TCRm抗體與pMHC復(fù)合物結(jié)合的結(jié)構(gòu)信息對開發(fā)針對不同患者群體的治療方法很有價值。TCRs與pMHC復(fù)合物的親和力在1到100mmol/L之間，而TCRm抗體可以有更高的親和力。例如，ESK1，一種針對WT-1的TCRm抗體，其對WT-1具有亞納摩爾的親和力，比天然TCR的親和力高1000倍。與TCRs和其他TCRm 抗體對pMHC復(fù)合物的結(jié)合方式相比，ESK1具有不同的模式（圖4）。ESK1的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域結(jié)合在HLA區(qū)域是TCRs無法觸及的區(qū)域。此外，ESK1結(jié)合部分多肽，而這些多肽只占總的pMHC接觸面的15%。肽上的結(jié)合比例在各種TCRm抗體中是不同的。最近發(fā)表在Science上的一項研究表明，H2-scDb抗體與肽和HLA-A02都有結(jié)合，并且與兩者的接觸面分別占50%左右（圖5）。此外，晶體結(jié)構(gòu)研究顯示，ESK1與HLA受體和多肽的結(jié)合率高達(dá)85%。有趣的是，這個區(qū)域在HLA-A02亞型之間是比較保守的。因此可以推測，ESK1可以與HLA-A02家族的其他亞型結(jié)合，并且這種推測已經(jīng)通過親和力實驗得到驗證。這潛在地擴(kuò)大了具有不同HLA-A02亞型的目標(biāo)病人群。除了基于可溶性TCR的構(gòu)建體和TCR工程細(xì)胞外，基于TCR的藥物的一個主要限制是，它們對特定HLA亞型的限制。結(jié)構(gòu)上的發(fā)現(xiàn)表明ESK1可能可以克服HLA亞型限制的限制。因此，TCRm療法可能有比基于TCR的藥物有更廣泛的治療應(yīng)用。

 

TCRm抗體在治療中的應(yīng)用

 

TCRm抗體為癌癥治療提供了新的基于抗體的免疫治療的方法。表2列出了已經(jīng)被報道的用于腫瘤治療的TCRm抗體。從篩選方式上來看，基本上所有TCRm抗體都是通過噬菌體展示和雜交瘤篩選。

 

 

與傳統(tǒng)的抗體藥類似，TCRm抗體通過抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒作用（ADCC），細(xì)胞毒性（ADCC）、抗體依賴性細(xì)胞吞噬（ADCP）或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性（CDC）等發(fā)揮作用。在研究中，可以使用不同的方法，包括增強(qiáng)ADCC、ADCP、工程雙特異性mAbs、免疫毒素、抗體藥物結(jié)合物（ADC），以及與其他治療方式相結(jié)合等，提高TCRm的藥效。例如，經(jīng)過改造的ESK1抗體ESKM，增強(qiáng)了對FcgR的結(jié)合和減弱了對FcgRIIb的結(jié)合能力，從而抗體的ADCC效應(yīng)。此外，ESKM可以和各種酪氨酸激酶抑制劑的聯(lián)合使用提高治療效果。

 

TCRm抗體同樣也可以被開發(fā)用于CAR T細(xì)胞治療。CAR主要由特異性的細(xì)胞外抗體部分、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)（包括CD3 zeta鏈和一些共刺激結(jié)構(gòu)域）組成。一些基于TCRm抗體構(gòu)建的CAR-T已經(jīng)被報道，如利用WT1 抗體構(gòu)建的CAR-T已經(jīng)在體外和體內(nèi)實驗中取得療效；同時也有研究者構(gòu)建靶向gp100 pMHC復(fù)合物的CAR-T療法，用于治療黑色素瘤。. 由這種TCRm衍生的CAR T細(xì)胞顯示了對腫瘤的特異性細(xì)胞毒性，并在異種移植模型中抑制了黑色素瘤的生長。目前，AFP CAR-T細(xì)胞療法是進(jìn)展最快的基于TCRm抗體構(gòu)建的CAR-T療法，正在進(jìn)行臨床試驗（NCT03998033）。該療法由Eureka開發(fā)，在臨床前研究中，該療法在多種肝癌模型中取得了較理想的結(jié)果。

 

 

 

TCR融合蛋白

 

當(dāng)然，除了利用抗體結(jié)合pMHC復(fù)合物外，immunocore公司開發(fā)了TCR融合蛋白+抗體的ImmTAC平臺，該平臺中，改造后的融合蛋白以更高的親和力與pMHC（HLA）復(fù)合物結(jié)合，而其抗體部分通過與T細(xì)胞表面的CD3結(jié)合，從而激活T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。目前基于該平臺構(gòu)建的Tebentafusp（靶向HLA-A*02:01和gp100復(fù)合物）已經(jīng)位于臨床Ⅲ期，并且預(yù)計今年第三季度申請BLA。

 

 

總結(jié)
 

TCRm抗體目前大多數(shù)都處于臨床前。而且TCRm抗體的開發(fā)仍然面臨著幾個重要的挑戰(zhàn)。首先是pMHC復(fù)合物表達(dá)，生產(chǎn)足夠多的高質(zhì)量pMHC復(fù)合物既費時又費力。其次，脫靶效應(yīng)可能阻礙了TCRm抗體治療的應(yīng)用，因為多數(shù)pMHC復(fù)合物可能不只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而且可能在正常組織中表達(dá)量很低。此外，因為pMHC中的肽都比較短，TCRm抗體可能與其pMHC復(fù)合物存在交叉反應(yīng)性。而單域抗體也許可以解決以上問題，與其它抗體相比，單域抗體較小，而且僅有重鏈，因此可以深入到pMHC結(jié)合肽的“溝”中，從而特異性結(jié)合肽與pMHC的構(gòu)象型表位，另外，單域抗體可以很容易的構(gòu)建雙表位的抗體甚至三表位的多特異性抗體。最后一個挑戰(zhàn)是，細(xì)胞表面的MHC-I復(fù)合物的表位密度低，以及抗原表達(dá)的下調(diào)并造成耐藥性。現(xiàn)在有一些可能的方法可以用來解決這一挑戰(zhàn)，如增加腫瘤中pMHC-I的表達(dá)，或者使TCRm抗體對低密度表位更加敏感，或者與其他藥物聯(lián)合治療，以及設(shè)計雙特異性的TCRm抗體等。

TCRm抗體可以將抗原范圍擴(kuò)大到細(xì)胞內(nèi)的蛋白，并有可能使許多 "不可成藥 "的靶標(biāo)可用于免疫治療。盡管還需很多努力來分離出特異性好的的TCRm抗體，但它們在靶向細(xì)胞內(nèi)蛋白方面具有很好的治療潛力。分離出更多針對現(xiàn)有的抗原或者新的抗原的TCRm抗體，改進(jìn)pMHC復(fù)合物的生產(chǎn)，TCRm抗體的研究，包括單域抗體的使用，抗體傳遞，結(jié)構(gòu)研究，以及TCRm的親和力成熟和減少TCRm抗體的免疫原性將推動針對細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的治療并有可能在未來將有效的抗體推進(jìn)到臨床應(yīng)用。

 

 

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